把经过室外前发酵的培养料搬运至室内，通过人工控温和控气，使培养料在特定的环境条件下消毒和发酵，进一步提高培养料的专一性和选择性，使培养料发酵成为更适宜于蘑菇生长的培养基质的过程称为室内后发酵。
① 原理：后发酵是一个生物化学反应过程，通过各种类型嗜热微生物的活动，促进堆肥理化性状发生变化。后发酵可分为两个阶段进行。 第一阶段：将堆温上升至57～60℃，保持6～8小时，这一阶段称为巴氏消毒，其作用一是高温下将大部分的病原性真菌的酶纯热化，特别是呼吸酶变化致死；二是高温使一些害虫（卵、幼虫、成虫）的蛋白质受热变性凝固致死；三是在这一温度范围内，为嗜热有益微生物提供生存活动的环境条件。 第二阶段：将菇房的料温通风降至48～52℃，保持5～7天，菇房空气温度不得低于45℃。其作用是一是由于通风降温，微生物氧的供应状况得到改善，促进嗜热微生物类群（包括嗜温细菌、放线菌和嗜温霉菌）大量增殖；二是将前一阶段后发酵中残留下的病原菌进一步杀死。
② 形式：根据我国内农村栽培蘑菇的条件，比较有效的后发酵形式有两种：一是利用菇房床架后发酵，把经过室外前发酵的培养料抖松后搬到菇房床架上（底层和顶层不放料），然后密闭菇房进行加温。二是利用蔬菜管棚或形状如蔬菜管棚的毛竹棚，在棚内两边搭一层离地15厘米的简易床架，床架宽大1.5米，中间走道宽1.2米（可以通过一辆小平板车），将经过室外前发酵的培养料置在床架上，堆至高0.8～1米、宽1.5米，料堆中间打一些洞，然后密闭加温进行后发酵，后发酵结束后，再将培养料搬到菇房床架上。这种形式虽增加一道工序，但后发酵时培养料的温度容易控制，后发酵质量高，而且节省能源。
③ 操作步骤a.进料的时间：室外后发酵第三次翻堆后，经过两天，料温可上升到最高温，一般在70℃左右，此时便可以进料。 b. 堆床：室外前发酵的培养料必须抖松后才可搬进后发酵房内。培养料搬到床架上后，要注意堆形，尽可能高一些，四周的堆边要平直，这样才能便于培养料保温，发酵均匀。 c. 加温：培养料进房后把门窗关紧，密闭菇房的各个通气口。开始加温的时间以进房后料温已经自动回升为好，一般进房后6～8小时后开始加温。料温上升至57～60℃后，保持6～8小时，然后进行适当通气降温，培养料温度降至48～52℃后，维持5～7天。培养料持温期间，室温不能低于45℃，并在这一阶段定时进行通气，防止后发酵室内缺氧而抑制有益微生物的繁殖和生长。后发酵结束后，要及时打开门窗，降温时门窗要由小到大开启。 d.调节培养料湿度：如采用蒸汽进行后发酵，则后发酵结束后培养料的含水量稍高，因此，培养料在室外发酵时可掌握适当偏干一些，含水量宜在60%。如采煤炉直接加温，因为煤炉所产生的干热会使培养料蒸发掉较多水分，后发酵结束后，可在培养料面上喷一些pH8～8.5的石灰清水，以调整培养料的含水量。
④ 后发酵结束后培养料的标准：色泽呈深咖啡至暗褐色，充分柔软，柴草有较强弹性，手握料时粪不粘手，并有较浓的料香味，无氨味，有大量白色放线菌和淡灰色腐殖霉菌，含水量65%左右，pH7.2～7.5，无害虫杂菌。
⑤ 后发酵要注意安全：培养料后发酵时应有两个人同时值班，防止在加煤时，由于菇房内温度过高或一氧化碳过多而发生意外。煤炉在菇房内安置要恰当，防止发生火灾。
