猪肌细胞生成素基因的多态性对荷包猪肉质的影响研究

　　关键词：荷包猪；MyoG基因；PCR-SSCP分析；肉质

　　荷包猪是东北民猪的一种，主要分布在辽宁、吉林和黑龙江3省。全身黑色，冬季生绒毛，鬃毛质量好，体质强健。面长直，耳大下垂。背膘平或微凹，胸深，四肢粗壮，卧系。后躯狭窄，倾斜。抗寒能力强，适应性强，耐粗饲，善奔跑，常年发病率低，肉质鲜美。

　　肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）是调节骨骼肌发育的重要因子，MyoG是生肌决定因子（Myogenin determination gene，MyoD）基因家族的成员之一。而生肌决定因子MyoD（也称肌肉调节因子muscle regulatory factory，MRF）基因家族编码4个明显不同的肌肉特异性转录因子：MyoD、MyoG、Myf5和MRF4，他们代表着控制骨骼肌生成很多方面的关键调节因子。其中，MyoG基因是MyoD 基因家族中唯一在所有骨骼肌细胞系中均可表达的基因，起到关键调节的作用。目前，国外对猪MyoG基因的多态性进行了较多研究，例如，Ernst等（1998）首先分析了猪MyoG基因的遗传变异，他们发现长度为4.9kb和4.2kb DNA片段为多态性片段，又在4个二代家系和三代家系中发现含4.9kb和4.2kb片段的MyoG等位基因分离符合孟德尔分离定律。对8个品种无亲缘关系的83头猪的MyoG等位基因的频率进行检测，发现含4.9kb和4.2kbDNA片段的MyoG等位基因出现频率分别为0.42%和0.58%。TePas等（1996）发现MyoG基因有3个变异位点：一个为梅山猪所特有，一个为荷兰长白猪和杜洛克猪所特有，另一个为所有研究的猪种共有的变异位点；初步研究表明这些变异位点与猪初生重、肌纤维数有关。近些年来，随着对猪MyoG基因的研究的不断深入，已经取得了一些新进展。MyoG基因作为改善猪肉类品质重要的候选基因，我们有必要对其进行深入研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　本试验所用优质纯种荷包猪和长白猪均由葫芦岛市建昌县民盛荷包猪养殖场提供。采用耳静脉采血。所有的试验猪均采血2mL左右。将血液放入有10%EDTA抗凝的离心管中并分别编号。采用PCR-SSCP技术分析，对所有试验猪进行MyoG基因型的检测，然后选取体重大约在75kg的各个基因型纯种荷包猪进行试验。

　　1.2 引物的设计

　　本次试验引用（Ann Soumillion，等，1996）年设计的引物，由沈阳宝泰克生物工程有限公司合成提供。引物序列为：

　　引物1，R1:5’-GGA ATT CCA TGG AGC TGT ATG AAC ATC-3’

　　F2:5’-TCC GGC TCC TCC CTG GTT GA-3’

　　引物2，R1:5′-TCA GGA AGA ACT GAA GGC TG-3′

　　F2: 5′-GTT TCC TGG GGT GTT GC -3’

　　1.3 PCR-SSCP 分析

　　PCR扩增体系50μL。扩增条件：预变性温度为93℃、3min。变性93℃、35S，退火温度为61℃、30S。72℃延伸30S。

　　取PCR产物，加入变性剂、石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中8min以上，再全部上样，10～15℃（具体温度依试验而定，不能太高）下电泳。开始在220V电压下电泳10min，然后在140V（电压不能高于120，否则有可能使条带跑弯）电泳12h，取下凝胶，进行银染，最后进行数码照相。

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　　　2 试验结果

　　2.1 PCR扩增结果

图1 MyoG exon1-1（1）的PCR扩增结果（bp）

图2 MyoG exon1-1（2）的PCR扩增结果（bp）

　　2.2 PCR-SSCP的检测结果

图3 MyoG SSCP的检测结果

　　　图3中，PCR扩增产物的SSCP检测结果：4、6、7、10为AA基因型；1、2、5、8为AB基因型；3、9为BB基因型。

　　2.3 结果统计

　　由表1可知，MyoG基因的多态性对荷包猪滴水率的影响未到达显着效果（P>0.05）。

　　对嫩度的影响达到了显着水平（P<0.05）。AA型基因的嫩度值最大，AB型基因的嫩度最小，BB型基因的嫩度介于两者之间。

　　在对大理石纹方面的影响上没有达到显着水平（P>0.05）。在肌内脂肪方面其影响达到了显着水平（P<0.05），AB型基因的荷包猪肉中其含量最高比AA型基因和BB型基因的含量分别高出了0.16%和0.29%。

　　对pH值的影响，MyoG基因的多态性对45min时pH值的影响没有达到显着水平（P>0.05）。但是对24h时的pH值的影响达到了显着效果（P<0.05），但是均在正常值的范围之内。表1 MyoG基因的多态性对荷包猪肉质的影响

　　注：同行肩标注不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），标有相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。下同。

由表2分析可以得出，在纤维面积、纤维直径和肌纤维密度方面，AA型基因、AB型基因和BB型基因的荷包猪肉3者之间都达到了显著水平（P<0.05）。

表2 MyoG基因的多态性荷包猪肌纤维组织学结构的影响

　　3 讨论

　　3.1 MyoG基因的多态性

　　本次试验选用了荷包猪和长白猪为对象，通过PCR-SSCP进行MyoG基因多态性分析，结果在外显子Ⅰ片段内出现多态性，结果同Soumillion等（1997）用PCR-RFLP方法进行MspⅠ酶切，共发现了3个位点相同。

　　3.2 MyoG基因对猪肉质指标的影响

　　滴水率是反映猪肉系水力的指标，是度量不加任何外力猪肉的液体流失状况。由试验结果可以看出AB型基因荷包猪的滴水率明显低于其他两种，这说明AB型基因荷包猪肉的保水能力强。目前对猪肉嫩度的研究发现，品种和遗传因素对肉的嫩度影响很大。我国地方猪种肉质优良、肌纤维较细，肌内脂肪一般含量在3%以上，甚至在6%～7%，肉质鲜嫩、多汁，而外来品种由于对瘦肉率的过度选择已使肌内脂肪含量下降为1%～1.5%，远远低于最佳范围，因此肉质较粗糙。本次试验的结果也同样证明了地方猪种荷包猪的嫩度比引进猪种长白猪的嫩度好，且均达到了显着水平。最嫩的都为AB型的猪。肌内脂肪的含量直接影响着肉的嫩度和大理石纹，肌内脂肪荷包猪中含量最高的为AB型，这说明不相同基因在同猪种中作用有所区别，在大理石纹方面MyoG基因的多态性对荷包猪肉的影响没有达到显着水平。

　　pH值是作为评价劣质肉的标准（曾勇庆等，1990）。MyoG基因的多态性对肉45min时的pH值的影响不大，荷包猪没有达到显着的水平。但是对24h时的pH值的影响均达到了显着的水平，但是均在正常范围之内。因此，说明MyoG基因的3种基因对pH值的影响不大。

　　根据以往的一些研究表明，肌纤维越细猪的肉质越嫩（罗军，1989）。很多研究表明，我国的地方猪种肌纤维直径比引进猪种要细，因此，地方猪种的肉的嫩度较引进猪种要好。（杨博辉等，2001）分别对九龙牦牛和大通牦牛肌肉纤维直径进行研究，发现肌纤维直径与肉品的柔嫩度呈现曲线相关。

　　3.3 MyoG基因对猪肉肌纤维组织学结构的影响

　　本次试验在荷包猪肉中纤维面积最大的为BB型，且3者之间达到了显着水平；纤维直径最大为AB型，3者达到显着水平；肌纤维密度最大的为BB型荷包猪，3者之间也达到了显着水平，且荷包猪肉的纤维直径和纤维面积均小于长白猪，更加说明了荷包猪的肉质嫩度好于引进猪种长白猪的。