这是一种无性繁殖方法，分离技术较为简单，采用子实体的菌肉组织进行分离培养，也是获得纯菌种最常用的方法。可选用PSA或PDA等斜面培养基，而且所用的培养基必须保持斜面上无多余的游离冷凝水。分离的“种茹”要求：选择生长良好、朵形圆整、无杂菌污染和虫害的子实体。若菌盖表面有杂物，需用75%的酒精进行消毒。在无菌条件下，用手把茹掰成两半，再用火焰灭菌过的接种针钩取干净的小块菌肉，迅速拉入灭过菌的斜面培养基上，抽出接种针，塞上棉塞。一般要求分离多次多支试管，以便进行选择。因金针茹是盖小而肉薄的食用菌，也可采用特殊的髓部分离法进行组织分离，即左手抓住菌柄，右手持长柄镊子沿着茹柄方向去掉菌盖，这时菌柄的顶端露出弧形的生长点，用接种针钩取生长点的组织块移入斜面培养基中。之后，把已经分离好的试管放在适温(20~25℃)的条件下培养，大约经过36h左右，在组织块周围长出白色放射状的菌丝，10d左右即长满试管。挑选没有污染杂菌的试管，把金针茹的菌丝体接入新的试管培养基上纯化培养即为野生金针茹纯菌种。
